Son action est phase-spécifique de telle façon que la gemcitabine entraîne principalement la mort de cellules en cours de synthèse d’ADN (phase S) et, dans certaines circonstances, bloque la progression cellulaire au niveau de la limite entre la jonction des phases G1 et S. In vitro, l'action cytotoxique de la gemcitabine dépend à la fois de la concentration et du temps.
De werking ervan is fasespecifiek zodanig dat gemcitabine primair cellen doodt die DNAsynthese ondergaan (S-fase) en, onder bepaalde omstandigheden, de progressie blokkeert van cellen die zich in de overgang van de G1/S-fase bevinden. In vitro is het cytotoxische effect van gemcitabine afhankelijk van zowel concentratie als tijd.